La Ciudad nació como una Reducción Jesuítica a orillas del Río Paraná, llamándose oficialmente Nuestra Señora de la Encarnación de Itapúa.
Fue el 25 de marzo de 1615 cuando Roque González de Santa Cruz, un sacerdote jesuita, decidió fundar la misión y nombrarla, según la tradición bíblica, en conmemoración al día de la encarnación de la Virgen María.
Esta misión cumplía un doble propósito: la evangelización de los guaraníes de la zona y su protección contra el sistema esclavista de encomiendas, muy difundido en la época, que causaba estragos en las poblaciones nativas.
Inicialmente, estuvo asentada en lo que luego sería la Villa Baja, para luego trasladarse a la zona donde hoy se encuentra la Plaza de Armas. Luego de la expulsión de los jesuitas en 1767, la población disminuyó significativamente. Esta situación comenzó a revertirse con la llegada de los primeros inmigrantes europeos entre 1840 y 1850, quienes se afincaron en la zona y se dedicaron a echar nuevas raíces. Las fértiles tierras de la zona propiciaron el crecimiento y desarrollo de la población, de modo que la otrora misión se convirtió en pueblo, para luego pasar a la categoría de villa.
En el año 1843 la iglesia principal, construida por los guaraníes bajo la dirección de los jesuitas, fue demolida por decreto del entonces cónsul Carlos Antonio López. Los materiales se reutilizaron para erigir nuevas construcciones, como la catedral de Encarnación y el Cuartel de la Independencia ―hoy Colegio Inmaculada Concepción―.
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